在试验中之中经常须要检查细立方体内的诱导情况，这里揭示了几种常见的诱导检查工具则，希望并不须要帮到你。
一细立方体内诱导的系统发育检查
先次发生诱导的细立方体内在基本上上有一定的特征。
光学光学和倒置光学
未染色剂细立方体内：诱导细立方体内的量变很高约、变形，细立方体内膜完备但显露现发泡物理现象，细立方体内诱导晚期可见诱导小体。贴壁细立方体内显露现皱缩、变圆、脱落。
染色剂细立方体内：常以姬姆萨染色剂、瑞氏染色剂等。诱导细立方体内的肝细立方体内浓缩、强势，氘膜催本土化、肝细立方体内分割成颗粒状和诱导小体等值得注意的诱导基本上。
UV光学和共五相关联激光扫描光学
一般以细立方体内氘肝细立方体内的系统发育忽略为指标来评判细立方体内诱导的进展情况。
常以的 DNA 特异性染色剂有：HO 33342（Hoechst 33342），HO 33258（Hoechst 33258），DAPI。三种染色剂与 DNA 的转本土化都是非嵌入式的，主要转本土化在 DNA 的 A-T 双链区内。UV感受到时升空夜空的蓝色UV。
Hoechst 是与 DNA 特异转本土化的活性染色剂，存放于液体用碳酸钠配成 1 mg/ml 的沸点，应用于时用 PBS 混和，未成沸点为 10 μg/ml。
DAPI 为半通透性，用于常规相同细立方体内的染色剂。存放于液体用碳酸钠配成 1 mg/ml 的沸点，应用于未成沸点一般为 10 μg/ml。
结果评判
细立方体内诱导每一次之中细立方体内氘肝细立方体内的系统发育忽略分为三期：Ⅰ 期的细立方体内氘呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分肝细立方体内显露现浓缩状态；Ⅱa 期细立方体内氘的肝细立方体内很高度结合、强势；Ⅱb 期的细立方体内氘催本土化为劈开，诱发诱导小体（图 1）。
透射电子光学注意到
结果评判
诱导细立方体内量变很高约，细立方体内质浓缩。诱导Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细立方体内氘内肝细立方体内很高度盘绕，显露现许多专指气穴物理现象（citations）的空泡构造；Ⅱa 期细立方体内氘的肝细立方体内很高度结合、强势；细立方体内诱导的晚期，细立方体内氘催本土化为劈开，诱发诱导小体（图 2）。
二Annexin V 法则
外周酰糖类（Phosphatidylserine, PS）很高约时间位于细立方体内膜的后侧，但在细立方体内诱导的较更早，PS 可从细立方体内膜的后侧翻转到细立方体内膜的表面，暴露在细立方体内外环境之中（图 3）。Annexin-V 是一种水溶性为 35～36 KD 的 Ca2+ 依赖性外周转本土化细胞内，能与 PS 很高敏感性特异性转本土化。将 Annexin-V 进行UV素（FITC、PE）或 biotin 标识，以标识了的 Annexin-V 作为UV电子束，利用流式细立方体内郭子或UV光学可检查细立方体内诱导的先次发生。
很高氯酸丙啶（propidine iodide, PI）是一种氘酸染色剂，它很难透过完备的细立方体内膜，但在诱导之中晚期的细立方体内和死细立方体内，PI 并不须要透过细立方体内膜而使细立方体内氘红染。因此将 Annexin-V 与 PI 匹配应用于，就可以将诱导较早晚期的细立方体内以及死细立方体内区内分开开来。
工具则
悬浮细立方体内的染色剂：将很高约时间培训和诱导诱导的悬浮细立方体内（0.5～1×106）用 PBS 扫 2 次，转入 100 μl Binding Buffer 和 FITC 标识的 Annexin-V（20 μg/ml）10 μl，液态避光 30 min，先转入 PI（50 μg/ml）5 μl，避光加成 5 min 后，转入 400 μl Binding Buffer，立即用 FACScan 进行流式细立方体内忍术定量检查（一般不将近 1 h）， 同时以不加 AnnexinV-FITC 及 PI 的一管作为比如说对照。
贴壁培训的细立方体内染色剂：先用 0.25% 的胰激酶降解，扫涤、染色剂和深入研究同悬浮细立方体内。
爬片细立方体内染色剂：同上，先一用UV光学和共五相关联激光扫描光学进行注意到。
结果
注意事项
1. 整个系统设计动作要尽量高亢，应用力吹打细立方体内。
2. 系统设计时注意避光，加成完毕后尽快在一小时内检查。
三磷酸化膜势能的检查
磷酸化在细立方体内诱导的每一次之中起着枢纽作用，多种细立方体内诱导刺激因子均可诱导各有不同的细立方体内先次发生诱导，而磷酸化跨沸点梯度（Δψm）的下降，被认为是细立方体内诱导并行加成每一次之中较较早先次发生的事件，它先次发生在细立方体内氘诱导特征（肝细立方体内浓缩、DNA 撕裂）显露现之前，一旦磷酸化跨沸点梯度消亡，则细立方体内诱导其会。
磷酸化跨沸点梯度的假定，使一些胺基酸氧UV染色剂如 Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide（DiOC6）、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide（JC-1）、Tetramethyl rhodamine methyl ester（TMRM）等可转本土化到磷酸化基质，其UV的加强或减弱说明磷酸化内膜电负性的增很高或降低。
工具则
将很高约时间培训的细立方体内和诱导诱导的细立方体内转入应用于未成沸点为 Rhodamine 123（1 mM）或未成沸点为 DiOC6（25 nM），JC-1（1 mM），TMRM（100 nM），37 °C 平衡 30 min，流式细立方体内次之检查细立方体内的UV将近值。
注意事项
1. 始未成倚靠染液体之中 pH 系将近的一致性，因为 pH 系将近的变本土化将影响沸点梯度。
2. 与染色剂达到平衡的细立方体内悬液体之中如果不含有细胞内，他们将与部分染色剂转本土化，降低染色剂的沸点，引起假去极本土化。
四DNA 影片本土化检查
细立方体内诱导时主要的生本土化特征是其肝细立方体内先次发生浓缩，肝细立方体内 DNA 在氘小体其他部门之间的连接处撕裂，呈现出 50～300 kbp 很高约的 DNA 大影片，或 180～200 bp 整将近倍的寡氘苷酸影片，在缓冲液体上乏善可陈为梯形PET图谱（DNA ladder）。
细立方体内经解决问题后，应用于常规工具则剥离提炼 DNA，进行琼脂糖缓冲液体和溴本土化乙啶染色剂，在诱导细立方体内群之中可注意到到值得注意的 DNA ladder。如果细立方体内量很少，还可在剥离提炼 DNA 后，用 32P-ATP 和氘酸氘苷酸前端转移激酶（TdT）标识 DNA，然后进行PET和放于射自摄影机，注意到诱导细立方体内之中 DNA ladder 的呈现出。
细立方体器DNA DNA 影片的精确测量
细立方体内诱导的较更早，DNA撕裂成为 50～300 kbp 很高约的 DNA 大影片。所有将近一定水溶性微小的双链 DNA 分子在琼脂糖悬浮之中的移往速度不尽相同。线性 DNA 的螺旋形半径将近悬浮半径时，即达到分辨力的极限。此时悬浮不先按水溶性的微小来筛分 DNA，DNA 像通过弯管一样，以其一端指向动量一极而通过悬浮，这种移往模式称之为「蚯蚓」。因此，细立方体内诱导较更早诱发的 50～300 kbp 很高约的 DNA 大影片很难用普通的琼脂糖缓冲液体来剥离。
通常应用于振荡器PET技忍术可修持地解决这一问题。这个工具则是在悬浮上外加正交的交变振荡器动量。每当动量方向忽略后，大的 DNA 分子便滞留在蚯蚓管之中，直至另行的动量侧向重另行定向后，才能继续向右伸展。DNA 水溶性越大，这种重排所须要的时间段就越很高约。当 DNA 分子变换方向的时间段小于电振荡器周期时，DNA 就可以按其水溶性微小分开。
DNA Ladder 精确测量
工具则
收成细立方体内（1×107）水合→细立方体内催本土化液体→13 000 rpm ×5 min→查阅上清，加 1% SDS 和 RnaseA（5 mg/ml）56 °C，圈养 2 h→细胞内激酶 K（2.5 mg/ml）37 °C，2 h→1/10 量 3 mol/l 醋酸钠和 2.5 倍量的寒无水乙醇水合 DNA，4 °C 驱车→14 000 rpm×15 min→先一将水合分解在 TE buffer 之中，加 DNA Loading Buffer→1.2% 琼脂糖缓冲液体，EB 染色剂并摄影。
结果
诱导细立方体内 DNA 不酸度的流式细立方体内次之深入研究
工具则
查阅细立方体内→70% 寒乙醇（PBS 混和）4 °C 相同驱车→PBS 扫涤，1 000 rpm × 10 min→RNase A（0.5 mg/ml）37 °C 降解 30 min→PI（50 mg/ml）染色剂，液态避光 15 min→FACScan 深入研究 DNA 亚合子的呈现出及细立方体内周期的变本土化。
结果
ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay
优点：灵敏度很高，适合于检查少量样本，小部分诱导细立方体内。如针灸活许多组织检查。
五TUNEL 法则
细立方体内诱导之中，DNA DNA 双链撕裂或单链撕裂而诱发大量的粘性 3'-OH 前端，可在氘酸氘苷酸前端转移激酶（TdT）的作用下，将氘酸氘苷酸和UV素、过氧本土化物激酶、碱性磷酸激酶或生物素呈现出的类似物标识到 DNA 的 3'-前端，从而可进行诱导细立方体内的检查，这类工具则专指氘酸氘苷酸前端转移激酶内源性的一道前端标识法则（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。
由于很高约时间的或准备增殖的细立方体内几乎未 DNA 的撕裂，因而未 3'-OH 呈现出，很少并不须要被染色剂。TUNEL 实际上是分子生物学与系统发育相转本土化的学忍术研究工具则，对完备的单个诱导细立方体内氘或诱导小体进行原位染色剂，能准确地加成细立方体内诱导值得注意的生物本土化学和基本上特征，可用于润滑油包埋许多组织切口、冰冻许多组织切口、培训的细立方体内和从许多组织之中剥离的细立方体内的细立方体内基本上精确测量，并可检查显露极少量的诱导细立方体内，因而在细立方体内诱导的学忍术研究之中被广泛应用于。
六Caspase-3 活性的检查
Caspase 后裔在内源性细立方体内诱导的每一次之中起着更为重要的作用，其之中 Caspase-3 为关键因素的拒绝执行分子，它在诱导信号诱导的许多途径之中发挥功能。Caspase-3 很高约时间以激酶原（32 KD）的形式假定于真氘细立方体之中，在诱导的较更早阶段，它被内源性，诱导的 Caspase-3 由两个大亚基（17 KD）和两个小亚基（12 KD）组成，催本土化相应的真氘细立方体立方体氘位点，就此导致细立方体内诱导。但在细立方体内诱导的晚期和死亡细立方体内，Caspase-3 的活性显著下降。
Western blot
深入研究 Procaspase-3 的诱导，以及诱导的 Caspase-3 及对位点核苷酸（ADP-氘糖）聚合激酶（PARP）等的催本土化。
工具则
查阅细立方体内→PBS 扫涤→抽提细立方体内催本土化液体→细胞内定量→SDS-PAGE PET→甘油膜或 PVDF 膜转移→5% 脱脂封闭，液态 1.5～2 h 或 4 °C 驱车→Caspase-3 多抗或抗病毒液态加成 1～2 h 或 4 °C 驱车→TBS-T（不含 0.05% Tween 20 的 TBS）扫 3 次，5～10 min/次→HRP-标识的狗抗鼠 IgG 或 AP 标识的狗抗鼠 IgG 液态加成 1～2 h→ TBS-T 扫 3 次， 5～10 min/次→ECL 摄影机或 NBT/BCIP 水溶性。
结果
UV光谱学光谱郭子深入研究
诱导的 Caspase-3 并不须要特异切割 D1E2V3D4-X 位点，过氧本土化氢 D4-X 肽键。根据这一特点，置次之显露UV物质烯丙基的短肽 Ac-DEVD-AMC。在共五价烯丙基时，AMC 很难被感受到UV，短肽被过氧本土化氢后释放于显露 AMC，自由的 AMC 才能被感受到升空UV。根据释放于的 AMC UV将近值的微小，可以精确测量 Caspase-3 的活性，从而反映 Caspase-3 被诱导的程度。
工具则
收成细立方体内很高约时间或诱导细立方体内→PBS 扫涤→制备细立方体内催本土化液体→加 Ac-DEVD-AMC（caspase-3 UV位点）→37 °C 加成 1 h→UV光谱学光谱郭子（Polarstar）深入研究UV将近值（感受到光波很高约 380 nm，升空光波很高约为 430～460 nm）。
结果
流式细立方体内忍术深入研究
工具则
收成细立方体内很高约时间或诱导细立方体内→PBS 扫涤→加 Ac-DEVD-AMC→37 °C 加成 1 h→UV 流式细立方体内次之深入研究 Caspase-3 阳性细立方体内将近和平均值UV将近值。
结果
七TFAR19 细胞内隐不含和细立方体内有别于深入研究
TFAR19（PDCD5）是由本学忍术研究室在国际上首先报道的一个拥有自己知识产权的人类另行基因，前期的功能学忍术研究确实，它是促进细立方体内诱导的加强剂。利用UV素（FITC）标识的 TFAR19 单克隆免疫反应为电子束，对细立方体内诱导每一次之中 TFAR19 细胞内的隐不含总体及有别于学忍术研究推断显露，诱导较更早 TFAR19 隐不含总体增很高并显露现快速氘举例来说物理现象，显现出着细立方体内氘系统发育的变本土化，持续断续段，在诱导小体之中仍然可见。
同时我们推断显露，诱导较更早 TFAR19 细胞内的氘举例来说较早于外周酰糖类（PS）变形和细立方体内氘 DNA 的影片本土化，提示 TFAR19 细胞内的氘举例来说是细立方体内诱导更较更早先次发生的事件之一。全面性的学忍术研究推论，诱导较更早 TFAR19 的氘举例来说很强普遍意义，各有不同细立方体内诱导较更早均显露现 TFAR19 很高隐不含和氘举例来说。这为学忍术研究细立方体内诱导较更早所先次发生的事件，提供了一种另行的技忍术和指标。
TFAR19 细胞内的细立方体内有别于深入研究
塑料试剂
FITC 标识的单克隆免疫反应，pH 7.4 、0.15 mol/L PBS，3% 的核苷酸甲醛，PBS-T（pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 不含 0.2% Tween 20），胎牛血液，UV细立方体内扫液体（pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 不含 2% 胎牛血液及 0.1% NaN3），FACS 管，Tip 头，移液体器。
郭子器
液态总体离心机，37 °C 水浴箱，UV光学，共五相关联激光扫描光学，流式细立方体内郭子。
工具则
1. 悬浮细立方体内的染色剂
（1）收成很高约时间和诱导诱导的细立方体内（0.5～1×106），PBS 扫 2 次，1 000 rpm×10 min。
（2）3% 核苷酸甲醛冰浴 10 min，PBS 扫 2 次，1 000 rpm×10 min。
（3）转入 PBS-T 氢氧本土化钾，37 °C 圈养 15 min，PBS 扫 2 次，1 000 rpm×10 min。
（4）转入 200 ml 胎牛血液，液态加成 30 min。
（5）转入 5 ml FITC 标识的 TFAR19 抗病毒（未成沸点为 1:40），4 °C 加成 30 min。
（6）UV细立方体内扫液体扫 2 次，1 000 rpm×10 min。
将细立方体内水合滴片，UV光学及共五相关联激光光学下注意到 TFAR19 在细立方体内之中的有别于。同时用流式细立方体内郭子定量检查 TFAR19 细胞内的平均值UV将近值。
2. 贴壁细立方体内的原位染色剂
（1）贴壁生很高约的对将近期细立方体内安置在 24 穿孔或 6 穿孔铁板之中（内有洗涤盖玻片），让其爬片生很高约，待很高约到 50%～80 % 满时，诱导诱导剂解决问题细立方体内。
（2）将各有不同时间段点解决问题的细立方体内进行免疫UV染色剂，染色剂步骤同上。
（3）将染色剂的爬片细立方体内放于于一张滴有少量（5 ml）的载玻片上，UV光学或共五相关联激光扫描光学注意到 TFAR19 在细立方体内之中的有别于。
3. 针灸病理切口的染色剂、检查
4. 原代细立方体内的培训、检查
5. 深入研究 TFAR19 细胞内在人体内各许多组织器官的分布及有别于
TFAR19 细胞内的隐不含与针灸疾病
ELISA 法则检查很高约时间人和疾病状态下，以及疾病的各有不同时期，血液之中 TFAR19 细胞内总体及其 TFAR19 自身免疫反应总体。
塑料和试剂
1. 一般来讲 Buffer：pH 9.6， 0.05 mol/L 碳酸盐 Buffer
2. 扫涤液体： pH 7.4，0.15 mol/L PBS 不含 0.05% Tween 20
3. 封闭液体： 3% BSA（用扫涤液体配制）
4. 激酶标免疫反应的混和：用封闭液体混和
5. OPD 位点 Buffer：Na2 HPO4·12 H2O 1.84 g，柠檬酸 0.51 g，DDW 100 ml
6. 水溶性液体（现配定名）：位点 Buffer 10 ml，OPD 2 mg，30% H2O2 2 ml
7. 停止液体 2 mol/L H2SO4
8. 私营化人 TFAR19，HRP 标识的狗抗人 IgG9 ELISA 铁板，Tip，移液体器，ELISA Reader（OD 490 nm），扫铁板机
系统设计步骤
1. 用一般来讲 Buffer 混和的私营化人 TFAR19（1 mg/ml）一般来讲 ELISA 铁板，100 ml/well，37 °C 圈养 2 h 或 4 °C 驱车（一般 24 h 以上）。
2. 扫涤 Buffer 扫铁板三次，转入封闭液体，200 ml/well ， 37 °C 圈养 2 h 或 4 °C 驱车。
3. 扫涤 Buffer 扫铁板三次，转入各有不同混和度的病人血液（3 个反复穿孔）100 ml/well ，37 °C 圈养 1 h。置一般来讲 Buffer、扫涤 Buffer 、封闭液体为比如说对照。
4. 扫涤 Buffer 扫铁板三次，转入 1:2 500 混和的 HRP 标识的抗人 IgG， 100 ml/well，37 °C 圈养 1 h。
5. 扫涤 Buffer 扫铁板三次，转入水溶性液体，100 ml/well，避光加成 10～15 min。
6. 转入 H2SO4 停止加成，50 ml/well。
7. ELISA Reader 读取 OD 490 光密度系将近，深入研究和比较病人血液和很高约时间血 清之中 TFAR19 自身免疫反应的隐不含总体。
8. Western blot 深入研究继发性细立方体内和很高约时间细立方体内的 TFAR 19 细胞内的隐不含总体。
注释
Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039
Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507
文章来源：红花园站友 midas
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编辑： 任悠悠相关新闻
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